快速診斷新冠病毒,究竟難在哪里? | 藥明康德線上論壇實錄

▎藥明康德/報道

很多人說,這次引起疫情的新型冠狀病毒非常狡猾。在感染的初期,當患者還沒有出現明顯癥狀的時候,它在人體內的病毒載量就可以達到很高的水平,讓人防不勝防。為此,找到快速而準確的診斷技術,便成了有效控制疫情擴散的關鍵
本周,在藥明康德舉辦的“科學戰疫線上論壇”上,全球十多位來自不同領域的頂尖專家圍繞新型冠狀病毒疾病診斷、療法與疫苗的快速研發、如何應對下一場可能爆發的感染性疾病等話題,在時長3個小時的論壇里分享了他們的寶貴洞見,用科學指引我們前行。在這篇報道中,我們將送上關于“邁向更快、更精準的診斷”這一專題討論的實錄。如您想了解線上論壇的其他專題討論,請參見藥明康德昨日和今日的相關報道。

專題討論嘉賓:

張鋒,霍華德·休斯醫學研究所研究員;Broad研究所核心成員
Charles Chiu,加州大學舊金山分校(UCSF)傳染病學/檢驗醫學和醫學教授;UCSF-雅培病毒診斷與發現中心主任
施晨陽,艾迪康醫學檢驗中心首席執行官;思嘉基金管理合伙人
主持人:Nick Naclerio,Illumina風險投資基金創始合伙人
Nick Naclerio博士:我想請Charles Chiu教授首先為大家解讀一些最基本也是最關鍵的信息。COVID-19到底是什么?從何而來?它與我們所熟知的季節性流感,以及SARS有什么不同?
Charles Chiu教授:引起COVID-19的是一種冠狀病毒。冠狀病毒是一個病毒家族,目前約有7種人類冠狀病毒被證明會引起感染。其中4種是季節性的,包括OC43和HKU1病毒等,每年都會導致疾病。
其余3種則被稱為突發性冠狀病毒,因為它們會引起疾病的大規模爆發和流行。第一種是2002年出現的SARS冠狀病毒,然后是大約十年后出現的引起中東呼吸綜合征的MERS冠狀病毒。現在出現了第三種人類冠狀病毒,也就是這次的新型冠狀病毒。它是SARS冠狀病毒的近親,其基因序列與SARS冠狀病毒有80%是相似的。
它的確切來源尚未確定。我們知道的是,已知早期的病例發生在中國武漢,案例大都與當地一處海鮮市場有接觸史。
科學家通過觀察病毒的序列推測,就像MERS和SARS一樣,這次疫情可能是由動物到人類的病毒傳播事件引起的,也就是我們所說的人畜共患病傳播。我們需要知道的是,這是一種新型冠狀病毒,之前它從未出現在人類身上,直到過去的一兩個月才在中國武漢地區首次出現。
基因組測序等新技術的發展,改變了我們應對類似疾病爆發的方式,在這次新冠疫情的應對中起到了至關重要的作用。
2002年非典發生時,研究人員光是確認SARS病毒為一種新型冠狀病毒就花了數周的時間。那時研究人員必須培育病毒和使用其他相應技術才能完成這一步驟。而這次的冠狀病毒,科學家在一周內就獲得了其基因組成信息。一找到病毒,中國科學家就對這種特殊病毒的基因組成進行了測序。
這是非常重要的,因為獲得了基因組序列,我們就可以開發用于診斷感染以及檢測病毒的方法。此外,有了這個序列,我們就可以開發抗體測試來進行監測以及研究潛在的治療方法和疫苗。而弄清病毒序列是一切的前提,這對我們應對疫情的能力具有重大影響。

Nick Naclerio博士:接下來讓我們對話來自艾迪康公司的施晨陽博士,他在中國,可以為我們講述來自一線的檢測經驗。施博士,您能給我們介紹檢測相關的情況嗎?
 
施晨陽博士: 作為中國最大的獨立臨床實驗室之一,艾迪康為武漢提供PCR檢測試劑盒。目前,我們在中國有22個實驗室,其中約有一半參與了新型冠狀病毒的檢測工作。特別是在武漢的實驗室,從大約四周前就開始了測試,現在每天平均處理幾千個樣本。這些樣本主要來自武漢疾控中心,既有來自發熱患者的,也有來自確診的新冠肺炎患者,還有一些來自疑似患者。隨著中國各行業開始復工,我們也開始檢測復工人員。在戰疫關鍵期,包括我們在內的五家商業實驗室助力武漢當地公立醫院完成了大部分的病毒測試工作。
目前進行的所有診斷檢測,主要是使用市面上可獲得的PCR試劑盒。自從去年12月中國疾病預防控制中心對病毒基因組完成測序并對外公布后,許多公司迅速投入到PCR試劑盒的開發中。目前已經有十余個商業試劑盒通過了國家藥品監督管理局的批準,還有超過100個類似產品正在注冊中。這些還都是在中國原來就已廣泛采用的PCR技術的基礎上進行的補充和提升。這意味著,中國目前已經有一個非常完善的病毒診斷或檢測平臺以及相關能力。
Nick Naclerio博士:說到這里,很多人關心PCR檢測的假陰性問題,大家擔心PCR檢測是否足夠靈敏,是否會出現漏檢?
施晨陽博士:這個問題要比大多數人想象得更復雜。首先,正如我剛才提到的,時間非常緊迫。通常情況下,我們要開發一個PCR檢測技術,尤其是用于真實世界的臨床檢測時,需要很多步驟。它需要使用真實世界的證據,進行臨床驗證。一般來說,這可能會花去幾年的時間。然而,特殊時期,很多公司必須在極短時間內拿出檢測方法來。就像Charles Chiu教授所說,我們面對的是一個新病毒、新疾病,如何獲得檢測樣本是很大的挑戰。大部分試劑盒可能還沒有用真正的臨床樣本來進行臨床驗證。
其次,做檢測本身有很多步驟,從制備樣本開始,比如怎么采樣。鼻拭子、咽拭子樣本相對于血液樣本更加復雜,因為它們含有很多雜質。而且,對采樣人員的技術要求也更高。
接著還有樣本儲存和運輸的問題。新冠病毒是RNA病毒,眾所周知,RNA非常不穩定,因此存儲條件至關重要。所以我們需要一套實驗室操作流程來保證RNA的穩定性。這些步驟中任何一個問題都可能導致無法檢出病毒感染。
現在我們還不能準確地知道假陰性率有多高,這是因為,盡管我們已經做了大量的樣本檢測,但就像我之前提的那樣,不同的實驗室采用了不同的檢測試劑盒,且相應的患者記錄并不是很完備,所以很難去驗證這些結果。
Charles Chiu教授:除了樣本的分析外,還有臨床靈敏度的問題。這里的挑戰非常大,原因就是我要再次強調的,這是一種新病毒。臨床靈敏度數據與病毒載量有關。從患者體內獲取的鼻拭子樣本里,有多少實際的病毒?這方面的相關信息,直到最近一兩周才有一些發表的數據。因此,何時為檢測的最佳時間?在患者出現癥狀之前檢測?癥狀一出現立即檢測?還是等到癥狀嚴重需要住院再檢測?痊愈后還要不要持續檢測?對這些關鍵的問題,我們還沒有答案。
實際臨床過程中,COVID-19的特征和SARS很不一樣。感染SARS病毒時,一旦出現咳嗽、發燒等癥狀,那么鼻拭子、血液中的病毒載量就開始上升;等到病重轉入重癥監護病房(ICU),病毒載量達到頂峰。但新冠病毒不一樣,從目前已發表的一小組患者的數據來看,它的特征有點像流感,即很早就到達高峰。換句話說,被感染者剛出現癥狀之時,甚至在發作之前,病毒載量是最高的,最容易被檢測到。然而,隨著病情加重,實際上的病毒載量會下降。
所以從根本上來說,COVID-19可能具有不同于SARS的傳播特性。這也可以解釋為什么我們會看到COVID-19這么容易傳播。正因為檢測到的病毒實際數量與患者的臨床癥狀嚴重程度并不具有線性對應關系,使得病毒檢測變得極具挑戰性。
Nick Naclerio博士:您是說,在癥狀剛剛出現,甚至還沒出現的時候,病毒可能更容易被檢測出來。而等到患者病重的時候,反而很難獲得陽性的檢測結果,是這樣嗎?
Charles Chiu教授:是的。事實上,有些住院患者的核酸檢測結果會出現波動:今天檢測結果可能是陽性的,第二天就變成了陰性,第三天又變成了陽性。這說明,實際上很難用PCR之類的直接檢測方法來真正表征病毒感染。嘗試間接檢測或許是有效的辦法。
我們在感染性疾病中常用的一種方法是尋找針對該病毒的抗體,以檢測抗體來代替檢測病毒。舉例來說,如果有人感染了麻疹病毒,且沒有接種過疫苗,那么身體里就會產生針對麻疹病毒的抗體。同樣,假設被新冠病毒感染,我們的身體也會產生針對新冠病毒的抗體。但這在急性爆發時不是很有用,因為人體通常需要一兩周才能真正產生抗體。
另一種不用直接檢測病毒的方法是可以通過查看宿主反應來診斷感染。這就是一些更新的技術(例如RNA測序)可能發揮作用的地方。因為使用RNA測序,實際上可以確定患者對該病毒有什么樣的宿主反應。不同的感染類型,比如呼吸道感染,有不同的宿主反應。實際上,也已經有基于宿主反應在開發的臨床試驗。但新冠病毒的爆發還處于初期,因此尚未開發基于宿主反應的間接檢測。我認為,一段時間后,可能需要用間接檢測為現有的直接檢測測試做補充。
Nick Naclerio博士:據我了解,大約有10%的感染患者需要住院治療,死亡率可能是1%~2%。檢測宿主反應有助于確定哪些患者病情最重嗎?
Charles Chiu教授:我認為是的。以流感或結核病為例,已經證明了宿主反應標志物有判斷預后的能力。
我們可以看到一些跡象表明,COVID-19在其他國家持續蔓延。如何應對成千上萬的病例?我認為,通過診斷測試以幫助我們確定病例的優先級,判斷誰可以安全地在家中自我隔離,誰應該轉入ICU治療,是非常重要的信息。
Nick Naclerio博士:說到在家隔離,我不禁要問,將來是否有更好的方法讓人們待在家里進行網上診斷,而不是和其他患者擠在一起排隊等檢測。那么張鋒博士,我們知道您已經在進行一些基于CRISPR的開創性工作,來提供非常經濟的病毒診斷方法。您覺得這會提供一種居家檢測的手段嗎?
 

張鋒教授: 抗擊新型冠狀病毒爆發非常重要,也非常緊迫。我們和其他一些研究團隊在開發基于CRISPR的診斷方法,總體來說是通過改變CRISPR體系里的特定蛋白質,使它根據病毒或細菌特有的基因特征來識別不同的病原體。
我們研究的技術叫SHERLOCK。基本想法是,測試者只要提供血液、尿液或唾液樣本,然后把CRISPR蛋白和專門針對病毒特異性序列設計的短鏈RNA放入樣本混合,經過簡單的反應,就可以像驗孕棒一樣,非常容易地在試紙上讀出結果:一條線表示陰性(沒有感染)、兩條線表示陽性(感染)。
我們在實驗室里初步測試了這種方法的可行性。當然,由于我們還沒有來自真實患者的樣本,目前只用化學合成的病毒RNA片段進行了驗證。根據我們和其他研究組的結果,它能檢測到相當低濃度的病毒。這套檢測工具已發送到了世界多地的研究人員手中,尤其是中國,還有歐洲。我們希望很快可以看到這套測試工具在真實患者樣本上的靈敏度如何,尤其是能不能精確診斷出新冠病毒的存在。
基于CRISPR的測試,我覺得最棒的是,只需要花很少的時間就能為新發現的傳染性病原體開發和設計新的檢測方法。我們從此次COVID-19中獲得的方法論,未來可以更快地應用于其他疾病。
除了在家就可以用試紙做的檢測外,我們和其他團隊也在把SHERLOCK技術應用于大規模診斷,比如我參與創立的公司Sherlock Biosciences就在做這個。一旦真的發生大規模流行,需要檢測很多樣品時,高通量的大規模診斷希望可以起到幫助。而居家個人測試和高通量檢測結合起來,都是為了更好地識別并抗擊傳染病。
施晨陽博士:正如張鋒教授描述的那樣,我認為快速測試是“戰疫”的重要機會。現在需要使用PCR試劑盒進行檢測,也需要有可靠且快速的測試,用于床旁診斷或家庭檢測。尤其是在復工之際,許多雇主和政府機構都希望員工上班之前做好保障。但顯然很難讓成千上萬甚至數百萬人一個個做核酸檢測。光是采樣就有問題,將這么多人排在同一房間,反而創造其他交叉感染的機會,更別說快速測試。因此,我希望看到快速測試以及自助采樣的檢測技術迅速發展,不僅有利于患者,更有利于對健康人群監測。
Nick Naclerio博士:很多觀眾提問,他們對CRISPR技術的治療潛力也很感興趣。您覺得CRISPR有沒有可能精確地靶向新冠病毒用于治療呢?
張鋒教授:當然,CRISPR本質上是細菌的防御系統,用于對抗病毒。所以,用它來對抗人體內的病毒是個很誘人的想法。大家開發了不同的Cas酶,有的靶向DNA,有的靶向RNA,因此CRISPR系統可以靶向DNA病毒或RNA病毒。新冠病毒是RNA病毒,SHERLOCK診斷法用的Cas13就是針對RNA的,理論上我們可以設計Cas13,讓它與新冠病毒RNA結合,破壞病毒的感染能力。就COVID-19而言,我認為了解疾病本身的生物學知識非常重要,比如需要知道病毒感染的組織。
而長期挑戰,也是CRISPR技術用于治療的主要挑戰,來自遞送,也就是我們怎么把酶、向導RNA有效且安全地送到細胞里面去消滅病毒。這也是我們現在主要解決的問題,有很多工作要做。如果我們有了合理的遞送方法,就可以嘗試治療病毒感染引起的疾病,比如肝炎,實現這個目標可能還需要幾年的時間。
但我認為非常重要的一點是,推進這些工作可以服務更長遠的前景。目前我們需要應對緊急的新冠病毒爆發,而將來還可能有其他爆發。持續地推進各種技術對于應對下一次疫情至關重要。
Nick Naclerio博士:一些聽眾在論壇的預熱提問中指出,這些病毒可能進化和變異,甚至變得更具致病性。Chiu教授是利用二代測序技術研究傳染病的專家,您認為二代測序在用于監測病毒方面可以對我們有何幫助?
Charles Chiu教授:二代測序就是高通量測序,可以從臨床樣品或RNA序列中生成數百萬個DNA序列。也就是說,我們可以直接從臨床樣品中組裝出病毒的基因組,這一點非常重要,可以跟蹤病毒隨時間的突變。
舉例來說,你可以追蹤具體的病毒簇,了解它如何在時空中傳播。這對于公共衛生來說太重要了。在寨卡病毒和埃博拉病毒等疫情的爆發中,我們和許多其他人實際上也已經開發出了一種方法,進行基因組監測。
實時監控病毒在人群中的傳播,也可以為公共衛生干預手段提供信息,讓我們知道該采取哪些措施來預防或減少病毒的傳播。我相信在診斷感染的同時,我們還應該盡量完成更多的病毒基因組測序。這樣就可以讓我們更好地知道病毒如何不斷發生變化,如何傳播,從而讓我們更好地預測未來,并希望能預防病毒的進一步傳播。
Nick Naclerio博士:我們有很多研究人員想知道他們可以提供什么樣的幫助。施晨陽博士,也許您可以評論一下,學術研究人員或創業公司如何提供潛在的解決方案。

施晨陽博士:我想我們需要更多的人和資源來參與檢測方法和技術的驗證,以及從診斷的角度更好地理解病毒。就像之前討論的那樣,病毒載量如何隨時間發生變化,何時達到峰值?我們能從哪些樣本里檢測出病毒,以及相應的時間相關性是什么樣的?舉例來講,從鼻拭子和咽拭子里獲得的樣本,與血液或糞便里獲得的樣本,病毒載量可能是不一樣的。因此理解病毒的作用方式,以及它在體內的作用途徑,對于開發準確的診斷方法至關重要。

其次,獲取樣本也是現在的一個挑戰,我說的不是樣本數量,而是這些樣品的臨床記錄。所以我們需要建立一個樣本庫,詳細記錄樣本的臨床史,以便能夠正確驗證這些檢測方法。當然,我認為像數字PCR、下一代測序等新技術,尤其是便攜式的新技術,可以將快速測序部署到醫院甚至社區中,這很重要,也很有價值。

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摘自: 藥明康德
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